Katharine Hepburn wuchs in behüteten Verhältnissen auf und genoss eine liberale Erziehung. Ihr Vater, Thomas Norval Hepburn (1879–1962), war Chirurg und Chef-Urologe am Hartford Hospital in Connecticut und machte als einer der ersten auf sexuell übertragbare Erkrankungen aufmerksam. Ihre Mutter, Katharine Martha Houghton Hepburn (1878–1951), war als Suffragette eine Kämpferin für das Frauenwahlrecht und eine Pionierin in der Bewegung für Geburtenkontrolle.
Hepburns Name kann bis ins 15. Jahrhundert nach Schottland zurückverfolgt werden. Zu ihren Vorfahren gehörte u. a. James Hepburn, 4. Earl of Bothwell, der dritte Ehemann der schottischen Königin Maria I. Die Hepburns hatten sechs Kinder. Der Geburtsname der Mutter wurde bei allen Kindern der Mittelname. Die Tochter von Katharine Hepburns Schwester Marion ist die 1945 geborene Schauspielerin Katharine Houghton. Mit ihr stand Hepburn 1967 für den Film Rat mal, wer zum Essen kommt gemeinsam vor der Kamera.
Am 3. April 1921 fand die damals 13-jährige Katharine Hepburn ihren Bruder Tom (* 1905) erhängt auf dem Dachboden des elterlichen Hauses. Sie dachte danach über einen eigenen Selbstmord nach, tat es aber nicht.[1] Suizid wurde von der Familie jedoch stets dementiert. Hepburns Eltern beharrten darauf, dass der Tod des angeblich glücklichen Jungen die Folge eines Unfalls gewesen sei. Katharine versank in schwere Depressionen und „verlegte“ ihren Geburtstag fortan auf den ihres verstorbenen Bruders (8. November). Erst in ihrer Autobiografie aus dem Jahr 1991 gab sie ihren wirklichen Geburtstag bekannt.
Als kleines Mädchen wollte Katharine angeblich lieber ein Junge sein. Sie besuchte die West Middle School und die Oxford School for Girls in Hartford, später ging sie ans Bryn Mawr College für Frauen in Pennsylvania. 1928 beendete sie ihr dortiges Studium mit einem Abschluss in Philosophie und Geschichte.